細胞計數(shù)儀是生物制藥、臨床檢驗、細胞治療領(lǐng)域的核心質(zhì)控設(shè)備，細胞計數(shù)儀驗證工作是保障計數(shù)結(jié)果準(zhǔn)確性的前提，而染色劑濃度作為驗證過程中的關(guān)鍵變量，直接影響活細胞、死細胞的識別準(zhǔn)確率，需結(jié)合細胞類型與檢測需求合理設(shè)定。
細胞計數(shù)儀通常依托染色劑區(qū)分活細胞與死細胞：活細胞的細胞膜結(jié)構(gòu)完整，能夠排斥臺盼藍、碘化丙啶等染色劑，在顯微鏡下或圖像識別系統(tǒng)中呈現(xiàn)無色透明狀態(tài)；死細胞的細胞膜通透性增加，染色劑可進入細胞內(nèi)部與核酸結(jié)合，呈現(xiàn)藍色或紅色熒光。若染色劑濃度設(shè)置不合理，會直接導(dǎo)致計數(shù)結(jié)果出現(xiàn)偏差。
染色劑濃度過高時，高濃度染色劑會破壞活細胞的細胞膜完整性，甚至滲入活細胞內(nèi)部與核酸結(jié)合，導(dǎo)致活細胞被誤染為死細胞，較終計數(shù)結(jié)果中活細胞占比偏低，死細胞率虛高。這種情況在原代細胞、干細胞等細胞膜較為脆弱的細胞類型中尤為明顯，比如臍帶間充質(zhì)干細胞檢測時，若臺盼藍濃度超過0.5%，就可能出現(xiàn)大量活細胞誤染的情況。此外，濃度過高的染色劑還可能在計數(shù)池內(nèi)形成沉淀，堵塞細胞計數(shù)儀的流路，影響設(shè)備的長期穩(wěn)定性。
染色劑濃度過低時，染色劑無法充分進入死細胞內(nèi)部，或熒光信號強度低于細胞計數(shù)儀的檢測閾值，導(dǎo)致死細胞無法被有效識別，與細胞碎片、背景噪聲混淆，較終計數(shù)結(jié)果中死細胞占比偏低，甚至漏計凋亡細胞。比如在PI染色檢測細胞凋亡時，若PI濃度低于1μg/mL，凋亡細胞的弱熒光信號可能無法被儀器捕捉，導(dǎo)致凋亡率檢測結(jié)果遠低于實際值。
確定合適的染色劑濃度需遵循“參考標(biāo)準(zhǔn)+預(yù)實驗驗證”的邏輯。首先參考染色劑的說明書，比如臺盼藍的常用濃度為0.4%，AO/PI雙染試劑盒的推薦濃度通常為1-2μg/mL。隨后使用標(biāo)準(zhǔn)細胞株開展預(yù)實驗，設(shè)置不同濃度梯度的染色劑，在相同條件下完成染色后，對比細胞計數(shù)儀的計數(shù)結(jié)果與顯微鏡人工計數(shù)的結(jié)果，選擇偏差較小的濃度作為驗證用標(biāo)準(zhǔn)濃度。同時需注意，不同細胞類型的適配濃度存在差異：懸浮細胞的細胞膜通透性通常高于貼壁細胞，所需染色劑濃度相對較低；血細胞等易染色細胞的染色時間需相應(yīng)縮短，避免染色過度。
在GMP合規(guī)的細胞計數(shù)儀驗證中，需將染色劑濃度作為關(guān)鍵參數(shù)寫入驗證方案，每次驗證前核查染色劑的配制記錄與有效期，定期更換不同批次的染色劑開展對比驗證，確保不同批次、不同時間的驗證結(jié)果具有一致性，為細胞治療產(chǎn)品、生物制劑的生產(chǎn)質(zhì)控提供可靠的數(shù)據(jù)支撐。
更新時間：2026-08-12
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